野生与养殖毒蛇的毒液间存在一定差异,而目前为止,

特种 (42) 2个月前

【摘要】:近年来,中华眼镜蛇的食用和药用等价值逐渐被重视,但由于多种因素导致野生中华眼镜蛇数量减少,因此,为达到满足市场需求和保护野生动物等目的,目前普遍采用人工饲料喂养和无冬眠快速养殖等技术大量养殖中华眼镜蛇。但是,已有报道指出野生与养殖毒蛇的毒液间存在一定差异,而目前为止,暂未见对其具体差异进行系统性比较分析的相关报道。蛇毒主要由几十种蛋白质(酶)或多肽构成的混合物(或“弹药库”),这些蛋白或多肽是由毒腺细胞里的毒素基因转录翻译表达出的,已有研究表明编码这些毒素的基因是经过亿万年的加速进化被募集到毒腺细胞里产生的,进而造成毒素蛋白的差异性。因此,本研究从毒液组成、成分活性、毒理学研究、毒素基因的转录组水平、不同喂养的食物等方面对野生和人工养殖的中华眼镜蛇毒液进行了比较分析,为人工养殖中华眼镜蛇的蛇毒生产及其咬伤治疗所用的抗蛇毒血清生产提供理论支持或指导。本研究通过系统性研究与分析,得到以下结果:(1)SDS-PAGE比较结果:变性SDS-PAGE显示,野生比养殖的眼镜蛇毒液多一条蛋白带(95 kD),且在55 kD处的蛋白含量较高;非变性SDS-PAGE显示,野生比养殖眼镜蛇毒液在170 kD处的含量高;RP-HPLC显示,野生比养殖眼镜蛇毒液在20min、50min处的出峰面积大。

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(2)酶活性比较结果:卵磷脂平板法进行PLA2活性测定,结果显示:上样量为30μg的野生的与养殖的眼镜蛇毒液水解卵磷脂后的透明圈平均直径分别为16.45 mm、18.38 mm;透明质酸平板法进行透明质酸酶活性测定,结果显示:上样量为30μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液水解透明质酸后的透明圈平均直径分别为12.81 mm、11.57 mm;亮氨酸为底物食用蛇养殖,测得上样量为10μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液L-AAO酶活性分别为0.341、0.397(用490 nm处吸光值表示活性大小);PNPP为底物,测得上样量为30μg野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液的碱性磷酸单酯酶活性分别为0.199、0.184(405 nm处的吸光值表示活性大小);碘化乙酰胆碱为底物,测得30μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液的乙酰胆碱酯酶活性分别为0.297、0.413(用405 nm处的吸光值表示活性大小);Azo-为底物,测得30μg的野生的与养殖的眼镜蛇毒液的蛋白水解酶活性吸光值分别为0.104、0.106(630 nm处的吸光值表示活性大小)食用蛇养殖,二者活性无显著差异;AMP为底物,测得20μg的野生的与养殖的眼镜蛇毒液的5’-核苷酸酶活性,酶活力大小分别为82.17 U、75.83 U。

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(3)毒理活性比较结果:经小鼠足趾皮下注射8μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液后的足趾胀胀厚度分别为3.6 mm、3.86 mm;经小鼠尾静脉注射8μg的野生的与养殖的中华眼镜蛇毒液后镇痛时间分别延长至7.5 s、6.86 s;经小鼠腹腔注射野生的与养殖的眼镜蛇毒液引起LD50的量无明显差异,分别为0.79μg/g、0.81μg/g,但野生眼镜蛇毒液的致死速度比养殖的中华眼镜蛇毒液的快。(4)转录组分析结果显示人工养殖的中华眼镜蛇毒腺中5’-NT、L-AAO、蛋白水解酶、乙酰胆碱酯酶的表达量相对于野生的呈上调趋势;PLA2、3-FTX的表达量相对于野生的呈下调趋势。(5)养殖组中华眼镜蛇的食物不同,导致其生长速度存在一定差异:食用活小鼠的中华眼镜蛇其生长速度较慢,喂养人工饲料的蛇则生长速度较快。而非还原SDS-PAGE显示:食用活体小鼠的成蛇,其毒液蛋白比喂养人工饲料的成蛇的毒液蛋白多一条蛋白带(90 kD);而食用活体小鼠的幼蛇农村养殖,其毒液的大分子蛋白含量比食用人工饲料的幼蛇的高;喂食小鼠四个月后:喂食小鼠的养殖眼镜蛇毒液中的PLA2活性、蛋白水解酶活性比喂食人工饲料的高,喂食人工饲料的养殖眼镜蛇毒液中的透明质酸酶活性比喂食小鼠的高。

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